Как проводится хроматография

Хроматографический анализ представляет собой один из важнейших типов современного анализа. Метод заключается в разделении смеси, компоненты которой имеют разные свойства, и, как следствие, различную скорость прохождения через среды. Он применяется как для качественного анализа смесей, так и для выделения чистых веществ. Будучи открытым в начале прошлого века, метод до сих пор активно развивается, на его основе проводилось и проводится масса исследований в биохимии.

Как проводиться хроматография?

При хроматографии нанесенная на неподвижную фазу смесь разделяется на группы веществ под действием подвижной фазы, элюента. Происходит это вследствие различных скоростей движения веществ.

Самый важный этап хроматографического анализа – подготовка условий, ведь каждая смесь обладает уникальными свойствами. Так, при неправильно подобранных условиях, разделения может не произойти, отдельные вещества не выделятся. Однако, самоцелью анализа может быть выделение только одного компонента. Например, для оценки концентрации гемоглобина в крови не требуются данные о всех других ее составляющих.

Под каждую цель подбираются специфичные смеси, позволяющие выделить искомые вещества. В зависимости от условий, степень разделения может быть разная. Библиотечные данные предоставляют информацию о поведении веществ в определенных средах в форме константы Rf (фактор удерживания). Он представляет собой отношение расстояния пройденных веществом и растворителем соответственно.

Для упрощения результатов могут менять как неподвижную, так и подвижную фазы. Неподвижная представляет собой бумагу, пластинку с силикагелем или другие сорбирующие материалы. На неё наносится анализируемая смесь, которая захватывается при движении элюента. Элюент в свою очередь движется по материалу за счет капиллярных сил.

Стандартными материалами для твердо жидкостной хроматографии являются либо бумага, либо пластинки с силикагелем. При необходимости бумага может модифицироваться, например, ацетилироваться. Это делает материал хиральным, что позволяет разделять смесь энантиомеров.

В тонкослойной хроматографии также используются модификации сорбентов, например -этерификация, взаимодействие с хлорсиланом и введение алкильных групп. Модифицированные пластинки позволяют разделять смеси более эффективно, делает их селективными к определенным свойствам.

Полученные пики интенсивности называются сигналами. Соотнеся полученные сигналы с библиотечными значениями или с внутренним стандартом, сигналы соотносятся с веществами. По интенсивности сигналов делается вывод о концентрации компонентов.

Бумажная хроматография

Бумажная хроматография представляет собой один из видов ТЖХ. От других методов ее отличает материал неподвижной фазы – целлюлоза. Стандартная или модифицированная, она служит сорбентом.

Ход бумажной хроматографии похож на ТСХ: На бумагу наносится проба смеси, затем лист помещается в закрытый сосуд, одним концом погружается в растворитель. За счет капиллярных сил, проба со стартовой точки захватывается подвижным растворителем и движется. По достижению раствором конца листа, последний вынимается и сушится. Для проявления полученных пиков интенсивности могут потребоваться дополнительные операции, например, обмакивание в фосфорную кислоту. Соотнеся расстояние пройденные веществами и растворителем, получают значние фактора удержания Rf. Параметр зависит от бумаги, раствора и самих веществ.

Высокая чувствительность метода делает его востребованным в биохимии, где навески пробы измеряются в микрограммах. Бумажная хроматография используется для идентификации искомых белков, проверки на наличие мутаций в них. После разложения протеиназой, из белков получаются пептиды, хроматограммы которых специфичны для различных белков.

Метод позволяет уловить различие белков в одну аминокислоту, что делает метод востребованным при поиске мутаций. Также, он позволяет указать на родство белков со сходными хроматограммами. Это полезно при доказательстве путей метаболизма. Так, например, указав на сходный состав двух белков, можно предположить, что один из них получен из другого путем добавления или отщепления структурных единиц.

Примеры хроматографии

Тонкослойная хроматография применяется при анализе лекарственных препаратов на предмет наличия в них нежелательных примесей, оценке качества выпускаемой продукции. Отклонения от стандартов могут указывать на ошибки производства.

Она применяется и при изучении окружающей среды, атмосферы, позволяя установить факт наличия в них вредных веществ, канцерогенов, превышение норм концентраций тех или иных газов.

Также, она широко распространена в научной деятельности, ведь предоставляет быстрые и точные анализы сложных смесей. Первичная оценка пробы помогает назначить эффективные пути дальнейшего разделения и подобрать необходимые условия для последующих реакций.

В нефтяной промышленности также востребована хроматорафия, необходимая для разделения и описания выделяемого топлива. Это позволяет классифицировать бензин по октановому числу, узнать о наличии в нем нежелательных примесей. Развитие жидкостной хроматографии позволило нефтепромыслу достичь новых высот в качестве выделяемой нефти, что привело к росту промышленности в целом.

Хроматографический анализ используется при маркировке продуктов питания: содержание белков, жиров, витаминов, углеводов и аминокислот. Точная оценка состава продукции является обязательным условием для торговли. Информация о потребляемой продукции позволяет людям формировать подходящую им диету, избегать непереносимой пищи.

В медицинской практике также повсеместно используется хроматография: диагностика состава крови и мочи позволяет не только установить факт заболевания, но и указать на его причину, помочь подобрать курс лечения и диету. По отклонению от нормы концентрации аминокислот можно судить о нарушении обмена веществ, о сбое в работе внутренних органов. Он также позволяет установить факт наличия ядов, что востребовано в криминалистике.

Выводы

Несмотря на то, что метод был открыт более ста лет назад, он до сих пор является широко востребованным. Проходя через постоянные усовершенствования, он позволяет разделять и анализировать необходимые смеси. Применение во всех областях человеческой жизнедеятельности является его простоты, скорости и дешевизны.

Для проведения анализа могут использоваться автоматизированные хроматографы, которые позволяют с высокой точностью изучать смеси за считанные часы. Автоматизация также удешевила сложнейшие на первый взгляд анализы в медицине.

Однако ручная хроматография при должных навыках не менее информативна и полезна. Колоночная хроматография позволяет разделить смеси, узнать ее состав.