Основные параметры хроматографических пиков
19.09.2023
В работе химика-хроматографиста важным является работа с хроматограммой. Все современные хроматографы компьютеризированы и работать с хроматограммой эксперту приходится в ПО. Хроматэк-Аналитик позволяет настроить почти все процессы обработки в автоматическом режиме, но всегда нужно проверять хроматограмму в ручном режиме. Если хроматограф используется для анализа проб разного состава, то без ручной разметки и проверки совершенно невозможно обойтись. Важно знать основные понятия, определения, правила разметки и причины появления «некрасивых» пиков.
Основные понятия.
Хроматограмма - представление сигнала газохроматографического детектора, как функции времени. По оси абсцисс откладывается время, по оси ординат — величина аналитического сигнала, которая тем больше, чем выше содержание данного компонента в разделяемой смеси.
Пик – часть хроматограммы, регистрирующая отклик детектора во время элюирования из колонки одного или более компонентов. Пик отображает постепенное нарастание концентрации детектируемого вещества в элюате и последующее её уменьшение. В случае линейной изотермы сорбции кривая, описывающая пик, приближается к кривой гауссова распределения. Часть пика, на которой зарегистрировано возрастание концентрации вещества до максимума, называется фронтом пика, а часть, которая отвечает уменьшению концентрации вещества, называется тылом пика.
Разметка пиков (интегрирование) — операция вычисления параметров пиков, полученных на хроматограмме путем определения характерных точек (начало, вершина и конец пика). При этом пики ограничиваются базовой линией (прямой, соединяющей точки начала и конца пика на нулевой линии).
Нулевая линия – участок хроматограммы, соответствующий сигналу детектора не содержащей вещества.
Время удерживания. Время от начала анализа до выхода максимума пика. Время удерживания – качественная характеристика анализируемого компонента, площадь и высота – количественные характеристики.
Площадь. Область, ограниченная профилем пика и базовой линией.
Высота. Расстояние от вершины пика до базовой линии.
Эффективность хроматографической системы ‒ параметр, характеризующий степень размывания хроматографического пика. Эффективность выражается числом теоретических тарелок (N):
- tR - время удерживания пика вещества
- W0,5 - ширина пика на половине высоты
Фактор асимметрии пика (As) – характеристика симметричности пика, рассчитываемая по формуле:
- W0,05 - ширина пика на 5 % (1/20) его высоты
- f - расстояние между перпендикуляром, опущенным из вершины пика, и восходящей стороной пика на 5 % его высоты
Если фактор асимметрии равен 1, то пик симметричен. Если фактор асимметрии больше 1, то это означает, что растянут тыл пика. Если фактор асимметрии меньше 1, то растянут фронт пика.
Разрешение (Rs) между пиками двух веществ смеси рассчитывают по формулам:
или
где tR2 ≥ tR1
- tR2 и tR1 - времена удерживания пиков
- W1 и W2 - ширина пиков у основания
- (W0,5)1 и (W0,5)2 - ширина пика на половине его высоты
Это самые основные понятия, с которыми сталкивается хроматографист в работе.
Современное ПО позволяет рассчитывать все указанные параметры автоматически. Пользователю бывает нужно только контролировать правильность разметки (начала и конца пиков, базовую линию, высоту). Контролировать правильность автоматической разметки нужно всегда! Даже для повторяющихся анализов одной и той же пробы могут возникать всплески, скачки, изменение шума и дрейфа.
Следует иметь в виду, что никакой алгоритм не может в ряде случаев (сложная форма базовой линии, плохое разделение хроматографических пиков, малые пики-наездники, высокий уровень шумов и т.д.) гарантировать корректную автоматическую разметку на пики. Само понятие "пик" во многом субъективно и зависит от конкретно решаемой задачи.
Проблемы с хроматограммами.
Рассмотрим основные проблемы, которые может увидеть химик на хроматограмме.
Всплески.
Пыль в трубопроводах может постепенно сдуваться и вызывать положительные всплески.
Отсоединить трубопровод и простучать выдувая потоком газа пыль.
Плохой контакт разъёма усилителя с электродом ПИД, ТИД, ЭЗД
Проверить качество контакта.
Отрицательные пики, отрицательные всплески
Анализируемый компонент присутствует в газе-носителе и его концентрация в пробе ниже, чем в газе-носителе
Используйте более чистый газ или применяйте фильтры, убирающие данный компонент из газа-носителя.
Отрицательные всплески – результат переключения клапанов и кранов
Уменьшать "мёртвые" зоны в газовой схеме, но это не всегда возможно из-за особенностей конструкции.
Ложные пики
Компоненты с предыдущих анализов.
Отредактировать режим. Увеличить время анализа или добавить продувку.
Неправильное хранение или разложение пробы
Использовать инертный контейнер. Проверить условия хранения.
Разложение пробы при анализе
Проверьте температурную программу. Если аналиты нетермостабильны, уменьшите температуру испарителя. Замените лайнер.
Недостаточное качество растворителя
Использовать более чистый растворитель, если это возможно.
Плохое качество газа-носителя
Загрязнения, поступающие с газом носителем (либо попадающие в поток газа-носителя в хроматографе: от лайнера испарителя, кольца уплотняющего лайнер) могут фокусироваться на начальном участке колонки в нижней изотерме. При программировании температуры вещества элюируются в виде ложных пиков. Закономерно для такого случая, чем больше времени ГХ находится между анализами (в первой изотерме), тем выше будет амплитуда ложных пиков. Для устранения этих загрязнений необходимо провести регенерацию или замену фильтров по газу-носителю, замену или очистку лайнера испарителя.
Грязный шприц
Заменить или промыть шприц
Грязь с септы испарителя
Используйте высокотемпературную малофонящую септу (мембрану).
Забросы пробы из канала сброса пробы
При работе с программированием давления (в том числе с программированием температуры и постоянной скорости/потоке через капиллярную колонку), или в режиме splitless поток по линии сброса пробы на краткое время замедляется или останавливается. Это может приводить к забросу компонентов пробы из линии сброса в испаритель. Затем компоненты могут фокусироваться в начале колонки и выходить в виде ложных пиков. Возможные пути решения: 1) Регенерировать фильтр сброса пробы. 2) При работе в режиме splitless использовать клапан перед фильтром сброса пробы и электронный регулятор обдува септы.
Монотонный восходящий дрейф
Грязный детектор
Проведите техническое обслуживание детектора.
Грязь в колонке
Проведите холостой анализ с заглушенной "ногой" детектора и при комнатной температуре термостат колонок. Если базовая линия улучшилась, значит диагноз верен. Выполните действия (каждое последующее в случае, если не помогло предыдущее): 1) Выполните кондиционирование колонки. 2) Отрежьте два оборота от входа в колонку (для капиллярных колонок). 3) Промойте колонку растворителем (только химически связанные фазы). 4) Замените колонку.
Новая колонка не кондиционирована
Выполните кондиционирование колонки.
Грязь с септы/лайнера испарителя
Сделать холостой анализ при комнатной температуре испарителя. Если нулевая линия улучшилась, заменить/промыть лайнер, установить более высокотемпературную септу.
Плохое качество газа-носителя
Используйте газ в соответствии с требованиями, изложенными в инструкции по установке хроматографа.
Резкий восходящий дрейф
Разложение жидкой фазы колонки
Проверьте анализируемую матрицу на совместимость с колонкой
Грязный детектор
Проведите техническое обслуживание детектора.
Попадание кислорода
Кондиционирование колонки может помочь. Если не помогло, замените колонку. Для предотвращения регулярно проводите проверки герметичности, меняйте септы испарителя. Используйте чистые газы и ловушки кислорода.
Грязь в колонке, химическое повреждение фазы
Проведите холостой анализ с заглушенной "ногой" детектора и при комнатной температуре термостат колонок. Если базовая линия улучшилась, значит диагноз верен. Выполните действия (каждое последующее в случае, если не помогло предыдущее): 1) Выполните кондиционирование колонки, отключив от детектора. 2) При работе с капиллярной колонкой отрежьте два оборота от входа в колонку. 3) Промойте колонку растворителем (только химически связанные фазы). 4) Замените колонку.
Новая колонка не кондиционирована
Выполните кондиционирование колонки.
Новая колонка не кондиционирована
Выполните кондиционирование колонки.
Перегрев колонки
Проверьте, не превышает ли температура в анализе или кондиционировании максимально допустимую по паспорту на колонку.
Плохое качество газа-носителя
Используйте газ в соответствии с требованиями, изложенными в инструкции по установке хроматографа.
"Хвостящие" пики
Объём паров превышает объём испарителя
Уменьшите объём пробы.
Перегрузка колонки
Увеличьте деление пробы в порте ввода, уменьшите её объём, применяйте разбавление.
Проба испаряется слишком медленно, неравномерно или конденсируется
Увеличьте температуру испарителя.
Неправильная установка колонки, неровная обрезка, негерметичность системы
Изучите руководство по эксплуатации. Заново обрежьте и переустановите колонку. Проверьте герметичность. Чаще хвостят менее удерживаемые пики.
Загрязнён лайнер или септ
Проявляется для химически активных компонентов. Замените септу. Промойте или замените лайнер.
Несоответствие пробы и растворителя
Смените растворитель. Используйте предколонку.
Плохая техника ввода
Часто связано с неравномерным движением поршня шприца при вводе пробы или её отборе в микрошприц. Используйте автодозатор.
Холодные области
Хвостят сильнее пики с большим временем удерживания. Где-то в линии пробы происходит конденсация. Проверьте прогрев линии пробы.
"Мертвые" объёмы в системе
Хвостят сильнее пики с большим временем удерживания. Проверьте соединения по линии пробы для исключения непродуваемых объёмов.
Свойства анализируемого компонента
Размытый задний фронт пика обычно имеют полярные вещества элюируемые на неполярной колонке с тонкой пленкой, или при работе на насадочных колонках – вследствие недостаточно высокого качества твердого носителя. Здесь "хвост" будут иметь не все пики.
Размывание во внешних устройствах ввода
Размывание из-за неправильной работы устройств ввода (парофазный дозатор, термодесорбер). Например, при работе с одностадийным ТДС с комбинированными трубками для легких компонентов десорбция из разных слоев трубки осуществляется с разной скоростью поэтому компоненты имеют размытый фронт.
"Фронтирующие" пики
Перегруз колонки
Увеличьте деление пробы в порте ввода, уменьшите её объём, применяйте разбавление.
Плохая техника ввода
Часто связано с неравномерным движением поршня шприца при вводе пробы или её отборе в микрошприц. Используёте автодозатор.
Несоответствие пробы и растворителя
Смените растворитель. Используйте предколонку.
Неправильно установлена колонка
Изучите руководство по эксплуатации. Переустановите колонку.
Мы описали частые определения и понятия с которыми сталкивается химик в работе с хроматограммами. Описали основные проблемы которые можно увидеть на хроматограмме и пути их решения. Со всеми случаями готовы помочь наши опытные сервисные инженеры.
